OBIECTIVELE PROIECTULUI

Obiective principale

 

Scopul proiectului nostru este de a depăşi aceste dificultăţi experimentale, astfel obiectivul general al proiectului nostru este de a transforma “paradigma CiPA” într-un standard industrial robust de încredere şi înalt reproductibil.

Obiective specifice:

– dezvoltarea de metode pentru a preveni imaturitatea preparatelor hiPSC-CM în homeostazia Ca2+ şi a limita efectele de inactivare a canalelor de Ca2+ de tip L  prin supraexpresia tranzientă de pompe de Ca2+SERCA/PMCA şi/sau buffering îmbunătăţit al Ca2+ citoplasmatic cu unităţi de calmodulină solubile

– utilizarea acestor preparate hiPSC-CM îmbunătăţite pentru a preveni problemele întâlnite la screening-ul canalelor ionice cardiace în linii celulare heterologe, cel puţin pentru anumite componente importante de curent ionic (curentul de Na+ de vârf şi tardiv, curentul de Ca2+ de tip L, curentul de K+ transient outward rapid, curentul de K+ inward rectifier miocardic (IK1), curentul „funny” activat de hiperpolarizare)

– dezvoltarea de teste pentru măsurarea efectelor farmacologice pentru un panel extins de canale şi transportori ionici, în condiţii naturale şi un mediu în care sunt prezente toate subunităţile auxiliare şi mecanismele reglatorii

– dezvoltarea şi rafinarea unui test proprietar (patentat) pe  hiPSC-CM prin combinarea de protocoale de current-clamp şi voltage-clamp cu scopul de a măsura cât mai multe componente distincte de curent ionic în condiţii fiziologice, cu soluţii interne şi externe fiziologice, în aceeaşi celulă, fără intervenţii farmacologice, şi în plus de a studia proprietătile electrofiziologice complexe ale celulei, cum ar fi intervalul intervalul de curent staţionar aplicat extern ce determină pacemaking sau proprietătile de restituţie a APD

– dezvoltarea unui model avansat umanizat de electrofiziologie a hiPSC-CM adecvat pentru teste farmacologice (folosind modele cinetice de tip Markov pentru multiple componente de curent ionic)

– dezvoltarea de algoritmi adecvaţi de calcul parallel/distribuit pentru integrarea numerică rapidă a modelului

– dezvoltarea de algoritmi de optimizare pentru a utiliza datele obţinute în experimente reale pe hiPSC-CM cu platforma de patch-clamp automatizat CytoPatch pentru a ajusta rapid parametrii modelului astfel încât să se obţină o concordanţă cu forma PA şi alte caracteristici determinate experimental în timp (aproape) real

– utilizarea în acelaşi experiment a unor protocoale de dynamic clamp pentru a valida modelul şi a testa efectele farmacologice ale medicamentelor candidate prin restaurarea formei PA cu curenţi generaţi electronic aplicaţi ca input în current-clamp în amplificatorul platformei CytoPatch.